问题1:得率低
原因1:裂解不充分。
样本混合不充分,建议样本加入ProteinaseK与BufferHLY使用震荡混合液;
ProteinaseK失活,建议ProteinaseK请放置在4℃保存,否则会导致其酶性失活。如长时间未使用请放置与-20℃保存;
样本预处理不充分,如使用组织样本请充分研磨破碎。
原因2:样本不新鲜。建议使用新鲜样本提取。
原因3:Buffer RW1、Buffer RW2未加入乙醇。
问题2:纯度低
原因1:样本裂解不充分。有大量的样本未裂解开导致纯度差。
原因2:盐类蛋白残留。使用 Buffer MKB(Buffer RB)与RNA wash Buffer洗涤时,注意管壁清洗,同时如蛋白残留过多可以增加 Buffer MKB(Buffer RB)再洗涤一次,如盐类一步残留可以再增加Buffer RW2洗涤。
原因3:醇类残留。空转完成后可以室温静止5min有利于醇类挥发。
原因4:gDNA污染。DNase | Mix失活:DNase I保存于-20℃。
问题3:RNA降解
提取时间时间不易过长,操作过程中请佩戴口罩,避免酶使RNA降解。建议在低温提取,提取过程中可以在冰盒上操作。
跑电泳条带:跑电泳条带发现RNA降解,跑胶过程中可以在冰面上跑,避免RNA降解影响跑胶结果。