【倍沃小课堂】质粒那些事儿（文末有惊喜）
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
在分子生物学实验中，通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上，构建新的重组质粒，目的基因可以随质粒载体进入到受体细胞中。 获得高品质的质粒对下游实验起到非常重要的作用。质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA，和质粒DNA的分离与纯化。质粒提取办法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特色。其原理是：强碱（pH12.0-12.6）环境下，SDS损坏细胞壁并裂解细胞，一同使宿主细胞的蛋白质、染色体及DNA发生变性，而质粒DNA因为其分子量小而缠结严密不易变性。pH调至中性时可恢复天然构象，在高盐条件下，细胞碎片、变性的蛋白质和染色体DNA发生沉积，离心后可去除。上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或许硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收。
A、菌种老化
建议：
对于甘油保存的菌种，需要先进行活化。请涂布平板，或划线接种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1：1000的比例进行菌种培养；注意，二次培养最好不要超过16h。B、质粒拷贝数低
建议：由于使用低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用2倍的菌体量（一般不超过10mL），并相应增加各种Buffer的用量，如果必要，更换具有相同功能的高拷贝数质粒载体。
C、质粒丢失
建议：某些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能出现质粒丢失的现象：例如Cosmid在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此请勿频繁转接，每次接种时应接种单菌落；另外，检查筛选使用的抗生素浓度是否正确；此外，摇菌时间过长造成菌种死亡，如PUC18的大肠杆菌摇菌时间不宜超过14h。
D、碱裂解不充分
建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。请根据选取的试剂盒，处理相应的细菌量。可适当减少菌体用量或者相应地增大各种Buffer的用量。对于低拷贝数质粒，如果菌液量超过5mL，提取时应加倍使用相应Buffer，有助于增加质粒收获量和提高质粒的质量。
E、溶液使用不当
建议：BufferB1，BufferC1，BufferN1在温度较低时可能出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温浴片刻，待溶液澄清后使用。另外，使用前，请在DNAWashBuffer中添加乙醇，做标记后使用。
F、吸附柱过载
建议：不同产品中吸附柱吸附能力不同。若需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若使用的是富集培养基（如TB或2×YT），上柱前的菌液体积必须减少。若质粒或宿主菌是高拷贝数或者高生长率，则需调整LB培养液体积。
G、质粒未全部溶解
建议：洗脱溶解质粒时，可放入37℃培养箱温育或者延长溶解时间。
H、离心柱中乙醇残留
建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇，再加入洗脱缓冲液。另外，对于质粒中提、大提和超大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻（或置于65℃烘箱），以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。
I、洗脱液加入位置不正确
建议：洗脱液应加在膜中央，以确保最好的洗脱效果。
J、洗脱液pH值不正确
建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5，如果洗脱液的pH值超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer（pH8.5，10mMTris-HCl）洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH值在7.0-8.5；另外，对于6kb以上的质粒，可将洗脱缓冲液加热至55℃，有助于提高洗脱效率。
K、洗脱体积太小
建议：洗脱体积将会影响最终收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。若需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，若想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。
L、洗脱时间过短
建议：加入ElutionBuffer后，室温放置2-5min，可达到较好的效果。
A. 蛋白质污染
建议：请选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清液，若上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白质。
B. RNA污染
建议：检查配送的RNase A是否完全加入到Buffer A1中，加入RNase A后，Buffer A1/RNase A应该存放在4℃，如果存放时间过长（半年以上），或者没有正确存放，RNase A活力下降，请重新加入RNase A至Buffer A1。另外，可减少菌体用量或加入裂解液之后室温放置一段时间。
对于大提试剂盒，请严格控制异丙醇的加入量。C. 基因组DNA污染
建议：加入Buffer B1后，应轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，否则基因组DNA碎片会混杂在质粒中。加入Buffer B1的处理时间最好不要超过5 min。此外，请注意菌体用量，若加入Buffer B1后过于黏稠，无法温和混匀，则减少菌体用量。细菌培养时间过长也会导致细胞和DNA的降解，培养时间请勿超过16 h。
D. 宿主菌含有内源性核酸酶
建议：有些宿主菌含有大量核酸酶，会在质粒提取的过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性。推荐使用不含核酸酶的宿主菌，例如DH5α 或TOP10。也可使用去蛋白液Buffer KB，去除残留核酸酶。
E. 裂解液加入时间过长
建议：Buffer B1加入后，放置时间不要太长，否则会有可能产生小片段DNA污染。
F. 乙醇残留
建议：漂洗液洗涤后，可延长离心时间，尽量去除残留液体，再加入Elution Buffer洗脱。
G. 存在质粒二聚体和多聚体
建议：在质粒复制过程中形成的，与宿主菌有关，电泳时可见，但不影响后续的酶切、转化、测序等实验。
Q:
加样时DNA飘出加样孔外
A. 柱中残留乙醇未除尽
建议：洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在硅胶膜上。可通过离心或者抽真空除去残留乙醇。
Q:
测序结果不佳
A. DNA测序用量过低
建议：调整测序反应需要的DNA量。若质粒浓度过低，可通过乙醇沉淀浓缩产物；送测序之前可通过电泳染色检测质粒的量。
B. Elution Buffer干扰测序结果
建议：使用DNase-Free的洗脱液或ddH2O溶解DNA作为测序模板。
Q:
酶切效果不佳
A. 内切酶的质量差或使用不当
建议：使用优质的限制性内切酶；按照厂家说明书正确使用酶；设立阳性对照检测内切酶活性。
B. 乙醇残留
建议：DNA Wash Buffer洗涤两次后，应空离1-2 min，以彻底去除残留乙醇。
Q:
质粒断裂
建议：细胞裂解过程应控制在5 min内，避免裂解时间过长引起质粒断裂。
Q:
宿主菌为G+，如何提取质粒
建议：G+菌要加溶菌酶进行破壁处理。
处理方法：收集适量的菌体，悬浮菌体后，加入溶菌酶使其终浓度为10-20 mg/mL，37℃处理30 min。加入溶菌酶的浓度和时间可根据不同的菌株和具体实验条件进行调整。之后的操作步骤按照相应说明书进行。我们的质粒纯化试剂盒常规可处理17 kb以下的质粒；
若质粒大小在20 kb以上，推荐使用大型质粒提取试剂盒。
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